夏季天氣越來越熱，很多養殖動物都(dōu)出現綠北了熱應激現象。對(duì)于肉到藍雞來說(shuō)，熱應激最直觀的表現是采食體近量和增重的下降及料重比的上升，嚴重影響肉雞生長(cháng)性能(né坐坐ng)及養殖經(jīng)濟效益。大量科學(xué)試驗顯示，包括凝結芽場電孢杆菌在内的多種(zhǒng)飼用益生菌對(duì)美火熱應激肉雞的生長(cháng)性能(néng區人)有不同程度的改善效果。本試驗通過(gu日票ò)在飼糧中添加不同水平的凝結芽孢杆菌，研究凝結芽孢杆菌對(duì)購相熱應激肉雞營養物質表觀代謝率、消化酶活性、腸道(d城文ào)形态以及腸道(dào)關鍵葡萄糖、氨基酸轉運載體蛋白mR還兒NA表達的影響，以期從飼料營養的消化與吸收角度較為系統地揭示凝結芽笑問孢杆菌改善熱應激肉雞生長(ch書海áng)性能(néng)的作用機制，為凝結芽孢杆菌在員笑肉雞養殖生産中的應用提供科學(xué)依據。
1.1試驗設計
按體重相近原則將(jiāng)320隻28學人日齡健康愛拔益加(AA)肉公雞随機分為事子5個組，每組8個重複，每個重複8隻。常溫對(duì)照組(TC組也身)肉雞飼養于(22+1)°C的常溫環境，飼喂基礎飼糧；熱應激組(美相HS組)肉雞飼養于(34+1)°C的山店高溫環境，飼喂基礎飼糧；熱應激試驗組肉雞飼養于上雪(34+1) °C的高溫環境，分别飼喂在基新一礎飼糧中添加0.2x107(HS-BC0.2組)、1.0 x107(HS-BC1.0組)、5.0 x107 CFU/g(HS-BC5.0組)凝結芽孢杆菌的河美試驗飼糧。試驗用凝結芽孢杆菌制劑(總菌數5.0x1010CFU/g，菌株編号YNAU 5517)由課題組制備。
1.2試驗飼糧和飼養管理
飼糧參考《雞飼養标準》(NY/T 33—2004) 配制，飼糧中不添加抗生素可朋、飼用益生菌、酸化劑等功能(néng)性添加劑。所有試驗飼糧均為顆粒料(80這影℃制粒)。試驗在雲南農業大學(xué)試驗雞場就知的2間溫控雞舍進(jìn)行，雞舍規格為短林長(cháng)x寬x高=7.7 mx4.2 mX2.4m，2間雞舍環境溫農遠度分别為(22士1)°C和(3姐理4+1)C。雞舍由電控鍋爐供暖、循環風控溫，試驗期間24h維持2間雞舍溫度對購。試驗雞為籠養方式，籠架為4層設計，共32個知麗籠，單籠規格為長(cháng)x寬x高= 140 cmx70 cm x3高高2cm。試驗期間自由采食、飲水，24 h光照。試驗期14 d。們快
1.3樣(yàng)品采集與指标檢測
42日齡時(shí)，所有試驗雞稱重下舊後(hòu)，每組以重複為單位随機屠宰1隻雞。取空腸食糜，于-20些黃 °C 保存，用于總蛋白酶和總澱粉酶活性的測定；取3~白紙4 cm空腸組織，于4%多聚甲醛固定，用于腸費又道(dào)形态的測定；取1cm空腸組織，立即轉畫朋入液氮，随後(hòu)-80C保存，用于葡票理萄糖和氨基酸轉運載體mRNA表達量的家機測定。28和42日齡時(shí)，測定試驗雞說計體重，計算初重和末重。試驗期間記錄采食量，計算平均日用朋采食量(ADFI)、 平均日增重(ADG)和F/G，以組為單章如位計算死淘率(死淘雞數占總雞數的百分比)。
收集試驗雞39~41日齡3d的排洩物，將(ji讀廠āng)排洩物上的羽毛、皮屑和飼錯歌料等挑除，稱重後(hòu)按10%的比例加入濃度為1內場0%的鹽酸，將(jiāng)收集3d的雪是排洩物混合制成(chéng)風幹樣(yàng)，粉碎過物唱(guò)40目篩密封保存，用于飼料營養物質表觀代謝唱雜率的測定，具體操作及檢測方法參考Rodjan等。
使用對(duì)應試劑盒，采用酶聯免疫吸附測定(ELI信體SA)法(HBS-1101型酶标分析儀，南京德鐵實驗設備有校時限公司)在450nm波長(cháng)下檢測空腸食糜總算她蛋白酶和總澱粉酶活性，操作方法按照說(shuō)明書進(jìn)行。女月總蛋白酶(試劑盒編号: YJ023854)和總澱粉酶(試劑盒編号:謝來 YJ035633)試劑盒購買于，上海酶聯生物科技有限公司。
挑取凝結芽孢杆菌的單個菌落接種(zhǒng)至MRS培養基中，于恒溫振蕩票笑培養箱(37.5 C、180 北雪r/min)培養24 h，制備菌液樣(y學報àng)品。随後(hòu)，取25 mL菌液離心(8000 r爸街/min、15 min)，獲得上清液樣(yàng)品。使用對(duì)應試劑盒，采用ELISA法(HBS-1子中101型酶标分析儀，南京德鐵實驗設備有限公司)在4到科50 nm波長(cháng)下檢測凝結芽微友孢杆菌的菌液和上清液。總蛋白酶和總澱粉酶活性。總蛋白酶(試劑盒編号:YJ036698)和總澱粉東裡酶(試劑盒編号: YJ05698要下7)試劑盒購買于上海酶聯生物科技有限公司。
腸道(dào)形态的檢測采用蘇木紅-伊紅(H醫術E)染色法，參照課題組前期報道(dào)， 簡述如下到科，將(jiāng)甲醛固定好(hǎo)的空腸組織經(j小醫īng)過(guò)脫水、石蠟包埋、切片、HE鐘上染色處理，再脫水封片。切片用光學(xué)顯微鏡鏡檢，每張切片觀測10睡近~20根連續的腸絨毛，用Case V車章ie-Wer軟件測量絨毛高度、隐窩深度，并計算絨毛高度/隐窩深度好畫。1.3.7腸道(dào)組織葡萄糖和氨基酸轉運載體朋和mRNA表達量采用實時(shí)熒光定量PCR ( rea煙森l-time quantitati雜唱vePCR)法檢測空腸鈉/葡萄糖協同轉運蛋白1 ( sodi-u說計m glucose co-transporter 1， 鐵著SGLT1)、鈉/葡萄糖協同轉運蛋白熱吃2 (sodium glucose co-transporter南懂 2，GLUT2)、基礎氨基酸轉運載體(紅劇basicamino acidtransporter，r現請- BAT)、y+L氨基酸轉運載體1雜妹(y+L a-minoacid transporter 舊也1，y LAT1)以及陽離子氨基酸轉運載體- 1 ( cation到花ic aminoacid transporter 1 ，CATH)的mRN她是A表達量。按照試劑盒方法提取組織樣(yàng)品總RNA，將(jiān中外g)總RNA反轉錄為cDNA進(j火民ìn)行實時(shí)熒光定量PCR。采用2-△△Ct法計算銀東目的基因mRNA表達量，内參基因為β-肌動蛋白( β-actin)。引物設唱通計參考Sun等。
1.4數據統計分析
試驗數據使用SPSS 21.0統計軟件分析進(jìn)行單因素路線方差分析和Duncan氏法多重事國比較，數據以平均值和均值标準誤(SEM)表示，P<0.05表示差異顯著筆報。2.1凝結芽孢杆菌對(duì)熱應激技嗎肉雞生長(cháng)性能(néng)的影響
由表3可知，與TC組相比，HS組的末重、ADG和術線ADFI顯著降低(P<0.0了道5) ，F/G顯著增加(P<0.05)。與HS了厭組相比，HS-BC1和HS_B銀村C組的ADG顯著增加(P<0理務.05) ；HS-BC0.2、HS-我湖BC1.0 和HS-BC5.0組的F/G分别降低了1.82%、6.82%、5.91%，盡管無信計顯著差異( P>0.05)，但有下降的趨勢。此外，HS組和HS-BC0.2組的死淘率較高，分多著别為17.19%和15.63%，而TC組和匠慢HS-BC5.0組的死淘率為0。2.2凝結芽孢杆菌對(duì)熱應說能激肉雞營養物質表觀代謝率的影響
由表4可知，與TC組相比，HS組的幹物質和粗蛋白質表觀代謝率顯著降雪西低(P<0.05)。與HS組下不相比，HS-BC1.0和HS-B白物C5.0組的粗蛋白質表觀代謝率顯著升高(P<0.05)，分别顯著提高了5.85%和7.96%，HS-BC0.2組的粗蛋白質表觀代謝率差異不顯著和電(P>0.05) ；HS-BC0頻這.2、HS-BC1.0和HS-B看畫C5.0組的幹物質表觀代謝率差異不顯著(P>0.05)街麗。以上結果表明凝結芽孢杆菌一定程度山說上改善了熱應激肉雞對(duì)飼料的消化與吸收，尤其提高了蛋白質消化與吸收，這(zhè)有助于改善肉雞跳放的增重，也與生長(cháng)性能(néng)的結果相符。
2.3凝結芽孢杆菌對(duì)熱應機如激肉雞空腸食糜消化酶活性的影響
由表5可知，與TC組相比，HS組的空腸食糜總澱粉酶和總明問蛋白酶活性顯著降低(P<0.05)開花，分别降低了14.44%和13.85%。與HS話輛組相比，HS-BC5.0組的空腸食糜總澱粉酶和總蛋司如白酶活性顯著增加(P<0.05) ，分别增加了1雨購2.51%和13.39%， H會國S-BC0.2和HS-BC1.0組的空腸食糜總澱粉酶和總蛋白酶活性差異不顯站來著(P>0.05)。
2.4凝結芽孢杆菌菌株産酶性能(房近néng)的體外檢測
由圖1可知，凝結芽孢杆菌培養菌液及其離心上清液中均含有車子澱粉酶和蛋白酶，且上清液中總澱粉她著酶和總蛋白酶活性均顯著高于菌液(P<0.05)員車。綜上所述，飼糧中添加的凝結芽孢杆菌進(jìn)入肉雞腸飛人道(dào)，分泌了多種(zhǒng)消化酶，提高了肉雞粗蛋白質表觀代謝率，這(zhè)可樹店能(néng)是凝結芽孢杆菌提高熱應激肉雞ADG、改善F/G就雜的重要機制之一。2.5凝結芽孢杆菌對(duì)熱應激肉雞空腸形态的影響
由表6可知，與TC組相比，HS組的空腸絨毛高度和絨門個毛高度/隐窩深度顯著降低(P&l術工t;0.05) ，空腸隐窩深度差異不顯著(P&腦朋gt;0.05)。與HS組相比，HS-BC1.0組的請理空腸絨毛高度顯著升高(P<物少0.05) ，HS-BC0.2和HSBC5.0組的空腸絨毛高度差南音異不顯著(P>0.05) ；HS-B城山C0.2、、HS-BC1.0和HS-下下BC5.0組的空腸隐窩深度差異不顯著(P&g家吧t;0.05) ；HS-BC1.0和HS-BC5.0 組的空腸絨毛和區高度/隐窩深度顯著升高(P<0.05) ，H喝很S-BC0.2組的空腸絨毛高度/隐窩深度差異不顯著(P&g雜去t;0.05)。與HS組相比， HS-BC1.0和HS-BC5.0組的空腸絨毛高度分别增加了9兵外.97%、7.55%，絨毛高度/隐窩可那深度分别增加了18.89%、13.商短17%。盡管與TC組相比，飼糧機廠中添加凝結芽孢杆菌組的以上腸道(dào一民)形态學(xué)指标未能(néng)完全恢複，但這(zhè)一作用效果提示凝結芽孢杆菌具有維持和/或修複環境熱應激引發(fā來我)的腸道(dào)損傷。除腸道(dào)組織損傷引發(fā)營養吸收面(miàn)喝資積的減少，腸上皮細胞營養轉運載技短體蛋白是影響熱應激肉雞對(duì)營養吸收的另一重要原厭不因，其中腸上皮細胞葡萄糖轉運載體蛋白SGLT1、GL男煙UT2以及氨基酸轉運載體蛋白rBAT、y+LAT1、CATH的作用十分關鍵，S分個GLT1主要分布在腸上皮細胞膜刷狀緣，負責將(jiāng)腸道影兒(dào)食糜中單糖轉入腸上皮細胞；GLUT2主要分近體布在腸上皮細胞基底側膜，負責將(jiāng)腸上皮細胞吸收的單糖轉入輛聽血液。r-BAT、y+ LAT1、CAT-1主要分布在小腸上皮細胞刷狀緣和從海基底膜，隸屬非鈉離子(Na+ )依賴性堿性和中性氨基酸轉運系統，對(duì)腸多影道(dào)酶解後(hòu)的氨基酸分子轉運吸收發(fā)揮關鄉她鍵作用，尤其是與增重相關的賴氨酸、組氨酸、精氨酸等必綠電需氨基酸1-1230。已有研究表明，熱應激顯著降低肉在畫雞腸上皮細胞SGLT1、r-B路嗎AT和y+ LAT1 mRNA表達量。
本研究表明（如圖2），與TC組相比，HS組的空腸SGLT1 mRN金事A表達量顯著降低(P<0.05)。與HS組相比，HS-BC1.0學放和HS-BC5.0組的空腸SGLT1 mRNA表達量顯著增謝河加(P<0.05) ， HS-BC0.2子那組的空腸SGLT1 mRNA表達量差異不顯著(P>0.05)。各謝和組之間空腸GLUT2 mRNA表達國月量差異不顯著(P>0.05)。
由圖3可知，與TC組相比，HS組的空腸r-BA都關T和y+LAT1 mRNA表達量顯著降低(動民P<0.05)。與HS組相比，HS-錯些BC1.0和HS-BC5.0-銀朋組的空腸r-BAT mRNA表達量國高顯著增加(P<0.05) ，HS-BC0.2組的空腸r-BAT 就亮mRNA表達量差異不顯著(P>了要;0.05) ；HS-BC0.2 HS-B吃城C1.0和HS-BC5.0組的空腸y+LAT1 mRNA表達量均顯著升高聽白(P<0.05)。各組之間空腸CAT-1 mRNA表達量差異計很不顯著(P>0.05)。以上結果表明，飼糧中添加1.0x107、5.0x107 CFU/g凝結芽孢杆菌有效上調了腸細胞營養轉運載體蛋白司大的表達，促進(jìn)了營養物質的吸收效率，這(zhè)是凝結芽孢杆菌一定如也程度改善熱應激肉雞營養物質表觀代謝率的另一重要原因。
凝結芽孢杆菌通過(guò)增加腸道(dào)消化酶活性、維持腸道(dào)形河坐态、促進(jìn)腸上皮細胞營養轉運載體蛋白表達友綠，提高了熱應激肉雞對(duì)飼糧營養物質的消化與吸收能(né木時ng)力，從而改善了生長(chán答多g)性能(néng)，且以1.0x107、5.0x107CFU/g凝結芽孢杆菌添加水平效果較好美著(hǎo)。[肖明霞，白華毅，袁麗紅， 趙平，李琦華]
